Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

バックグラウンド：乳がん患者の治療法の選択は、がんのサブタイプに大きく依存する。ただし、このプロセスは再発時の腫瘍生物学の変化によって複雑になる。喫煙は乳がんの危険因子として確認されている。乳腺組織に対する血液循環を介して送達されるタバコ成分の直接的な影響とその後のDNA損傷は、喫煙と乳がんの発癌との関連を説明するために提案されている。この仮定は、増殖能と悪性形質転換の増加によって示されるように、関連するDNA損傷が乳癌細胞をさらに変化させることを示す組織培養と動物研究の両方によってサポートされている。この研究では、エストロゲン受容体（ER）、プロゲステロン受容体（PgR）およびヒト上皮細胞増殖因子受容体2（HER2）の再発時の各受容体の発現変化と喫煙と再発後の予後との関係を調査することを目的とした。
方法： このレトロスペクティブ研究には、手術後に再発した原発性乳癌患者989人と、2007年12月から2018年3月に再生生検または外科手術を受けた50人の患者が含まれていた。 原発巣および再発時の採取検体でのER、PgRおよびHER2の発現を組織免疫染色法で評価し、その発現パターンと喫煙歴（パックイヤー）との相関を調べた。
結果：再発腫瘍でERを評価したところ、それぞれ3人（6.0％）および1人（2.0％）で陰性および陽性の変換が認められた。PgRを評価したところ、15例（30.0％）で負の変換が認められた。HER2を評価したところ、6人の患者（12.0％）で正の変換が認められた。その結果、再発性腫瘍の患者5人（10.0％）で内因性サブタイプの変化を観察した。ほとんどの臨床的要因は喫煙と相関していなかったが、再発時のHER2の正の変換は、非喫煙者よりも喫煙者の間で有意に高頻度であった（p = 0.024）。
結論：乳がん再発中の生物学的変化は、再発後の治療に影響を与えるため、慎重に臨床的に検討する必要がある。我々の結果は、喫煙が再発乳房腫瘍のHER2発現の増加を引き起こす可能性があることを示唆している。

DOI： 10.1186/s12967-020-02307-x

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背景/目的：ホストの全身性炎症反応は、癌の進行と化学療法の抗腫瘍効果に影響を与えると考えられている。メタ分析は、末梢血血小板対リンパ球比（PLR）がこの効果の予後指標であることを報告している。したがって、術前画像診断によりcT1N0M0乳がんと診断された患者のセンチネルリンパ節転移（SLNM）に応じて、PLRが異なる可能性があると仮定した。この研究では、cT1N0M0乳がんと診断された患者のSLNMを予測する術前PLRの能力を調査した。
患者と方法：この研究には、術前画像診断により診断されたcT1N0M0乳がんの475人の患者が含まれていた。末梢血は診断時、すなわち手術前に採取した。PLRは、血小板数の絶対値をリンパ球の絶対数で割ることにより、術前の血液検査から計算された。
結果：腫瘍の直径が10 mmより大きい場合、SLNMの確率は有意に高かった（p = 0.002）。SLNMの発生率は、高（術前）PLRグループで有意に高かった（p = 0.031）。多変量解析により、高いPLR [低いPLRと比較して、p = 0.021、オッズ比（OR）= 1.815、95％信頼区間（CI）= 1.093-3.090]と大きな腫瘍サイズ（小さな腫瘍サイズと比較してp = 0.001）が明らかになった、OR = 2.688、95％CI = 1.524-4.997）は、SLNMに影響する独立した要因であった。
結論：PLRはcT1N0M0乳癌におけるSLNMの予測因子として機能する可能性がある。

DOI： 10.21873/anticanres.14202

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Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：Domestic journal  

【目的】活動制限患者の手指衛生に対する看護師の認識と支援行動の実態を明らかにする。【方法】一般病棟の看護師250名を対象に自記式質問紙調査を実施した。【結果】有効回答のあった対象者160名の認識について「患者の手指は汚染されていると思う」は中央値5であり、他の項目は2〜4であった。支援行動は131名(81.9%)が実施し、内訳は「手指衛生が行えるよう介助をする」128名(97.7%)、「手指衛生の指導をする」56名(42.7%)で、その目的は「患者の清潔を保つ」115名(87.8%)、「患者自身の感染予防」108名(82.4%)などであった。「手指衛生が行えるよう介助をする」タイミングについて「いつも行っている」割合が最も高かったのは「患者の手指が目に見えて汚染している時」61.7%であり、最も低かったのは「面会者との交流後」0.8%であった。【考察】医療関連感染の拡大防止の観点から患者の手指衛生に対する看護師の支援行動の実施は不十分であり、その要因として看護師の認識が不十分であることが示唆された。(著者抄録)

Publishing type：Research paper (scientific journal)  

Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

背景/目的：エリブリンは現在、臨床現場で進行性および転移性乳がんの治療に使用されている。ただし、その効果は多くの場合、抵抗獲得によって阻害される。したがって、本研究は2つのエリブリン耐性乳がん細胞株を確立し、これらを使用して、エリブリン耐性獲得の根底にあるメカニズムを解析した。
材料と方法：エリブリン耐性乳癌細胞株は、MDA-MB-231およびMCF-7細胞をエリブリンの濃度を増加させて培養することによって樹立した。
結果：エリブリン耐性細胞は、エリブリンや他のいくつかの抗癌剤に対する耐性を獲得した。エリブリン処理後、エリブリン耐性細胞株は、形態学的変化、上皮カドヘリンの発現の増加、細胞周期分布の有意な変化を示さなかった。対照的に、プログラムされた死リガンド1の発現レベルは、MCF-7細胞と比較してMCF-7 /エリブリン耐性で増加した。
結論：本研究で樹立したエリブリン耐性細胞株は、さまざまな抗癌剤に対する交差耐性を獲得し、微小管機能および上皮間葉移行（EMT）に対するエリブリン誘発効果に対する耐性を示した。

DOI： 10.21873/anticanres.13559

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背景：腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の密度が高いほど、治療効果が高くなり、がん治療の予後が改善される。同様の結果が乳がん、特にトリプルネガティブ乳がん（TNBC）およびヒト上皮成長因子受容体2に富む乳がんで観察されている。カルシウムチャネルブロッカー（CCB）は、T細胞やマクロファージの機能を抑制することも報告されている降圧薬（AHT）である。この研究では、乳癌の術前化学療法（POC）の前にTILを評価し、CCBとTILまたは予後との相関を遡及的に分析した。
方法：POCで治療された患者のうち、評価可能なTILを持つ338人がこの研究に登録された。TIL間の相関を標準的な方法に従って評価し、CCBの使用と予後を遡及的に調査した。
結果：POCの前に、65人の患者（19.2％）がAHTを服用した（CCB：41 / 338、12.1％）。すべての患者のグループおよびTNBC患者のCCBを投与された患者では、TIL密度が有意に低かった（それぞれ、p = 0.040、p = 0.009）。さらに、CCBを投与されたTNBC患者は、POCに対して有意に低い奏効率を示した（p = 0.040）。POCを受けているすべての患者では、CCBを投与された患者で無病生存率（DFS）または全生存率（OS）に有意差は観察されなかった（それぞれp = 0.712、p = 0.478、ログランク検定）。さらにTNBCの患者でも有意差は見られなかった（DFS：p = 0.441、OS：p = 0.727、それぞれログランク検定）。
結論：CCBによる高血圧の治療を受けているTNBC患者では、治療前の針生検標本のTILは有意に低く、POCの奏効率は十分ではなかった。したがって、CCBの免疫抑制効果も免疫微小環境に影響を与える可能性がある。

DOI： 10.1186/s12885-019-5828-5

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DOI： 10.1186/s12967-019-1773-y

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Publishing type：Research paper (scientific journal)  

 ［Objectives］This study aims to elucidate the perceptions and supportive behaviors of clinical ward nurses toward hand hygiene of patients with limited activity.　<br> ［Methods］We conducted a self-documented questionnaire survey of 250 clinical ward nurses.　<br> ［Results］Overall, 160 respondents who addressed full items in the questionnaire identified “the hands of the patients considered to be contaminated” with the median score of 5 and that of other items ranged 2-4. In addition, 131 (81.9%) nurses supported the hand hygiene behavior of patients ; of these, while 128 (97.7%) nurses assisted patient hand hygiene, 56 (42.7%) guided patient hand hygiene. Supportive behaviors of patient hand hygiene aimed at the cleanliness care (115 nurses) and the infection prevention for patients themselves (108 nurses) , etc. Regarding the suitable timing of patient hand hygiene assistance by nurses, they always assisted “when the patient’s hands are visibly contaminated” (61.7%) at the most, and “after interaction with visitors” (0.8%) at the least.　<br> ［Discussion］Nurses’ supports for patient hand hygiene were unsatisfactory from the perspective to prevent the spread of health care-associated infection because their perceptions toward patient hand hygiene could be insufficient.

DOI： 10.18892/jsnas.18.0_78

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Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

背景： 乳がんの早期手術におけるセンチネルリンパ節生検（SLNB）による転移の診断は、腋窩リンパ節への転移の状態の正確な知見を提供し、現在では標準的な手順になっている。本研究では、画像診断で転移がないがSLNBで転移している場合のNAC前の腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の評価により、術前化学療法（NAC）後の腋窩リンパ節郭清（ALND）の省略が可能かどうか遡及調査した。
方法： cT1-2、N0、M0と診断された切除可能な早期乳癌の合計91人の患者がSLNBを受け、NACで治療された。治療前の原発腫瘍の生検標本におけるTILとして腫瘍周囲間質に浸潤するリンパ球の半定量的評価を行った。
結果： TILの数が少ない場合、エストロゲン受容体の発現は有意に高く（p = 0.044）、ヒト上皮成長因子受容体2（HER2）の発現は他の場合よりも著しく低かった（p = 0.019）。TILの数は、内因性サブタイプがホルモン受容体陽性乳がん（HRBC）である場合に有意に低かった（p = 0.044）。腋窩リンパ節への転移は、HER2陰性の症例とTILの数が少ない症例で有意に多かった（それぞれp = 0.019、p = 0.005）。
結論： cN0患者のSLNBで大転移が見つかった場合でも、原発腫瘍の免疫腫瘍微小環境が良好な場合、NAC後にALNDを回避できると思われる。

DOI： 10.1186/s12967-018-1692-3

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背景： 乳癌の予後とネオアジュバント化学療法（NAC）に対する治療反応は、固有の分子サブタイプによって異なる。NACと手術による治療後の再発乳癌患者における免疫組織学的サブタイプの予後的意義を評価した。
方法： 2007年から2015年の間にNACで治療された乳癌患者合計237人とその後の治癒手術が分析された。NACの固有の分子サブタイプと臨床病理学的特徴、予後、および病理学的完全奏効（pCR）率との相関関係を遡及的に調査した。
結果： 手術後に再発した患者は55名（23.2％）でした。サブタイプ間で再発後の生存率（PRS）に有意差は認められなかった（p = 0.397）。エストロゲン受容体陽性のヒト上皮成長因子受容体（HER）2陰性（管腔）悪性腫瘍の患者では、PRSは非pCRグループよりもpCRグループで有意に良好であった（p = 0.031）。逆に、pCRはトリプルネガティブ乳がん患者のPRS改善の有意な予測因子ではなかった（TNBC; p = 0.329）。多変量解析により、NACの有効性[ハザード比（HR）300.204、p <0.001]と初期転移部位（HR 15.037、p = 0.005）は、管腔内乳癌患者のPRSの独立した予測因子であり、一方Ki-67（ HR 51.171、p = 0.020）および初期転移部位（HR 13.318、p = 0.048）はTNBC乳癌患者のPRSの独立した予測因子である。
結論： 内因性サブタイプごとの予後因子は、NACおよび手術後の再発乳がん患者で個別に評価する必要がある。

DOI： 10.1186/s12967-018-1679-0

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Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

背景/目的： 免疫調節に関与するいくつかのタンパク質とこれらの間の関係、腫瘍微小環境、およびエリブリン治療の臨床転帰を進行性または転移性乳がん患者で評価した。
患者と方法： この回顧的コホート研究は、52人のエリブリン治療を受けた局所進行または転移性乳癌患者で構成されていた。癌組織サンプルは、10人の患者の治療の前後に取得された。免疫組織化学は、プログラムされた死（PD）-1、CD8、および間質性腫瘍浸潤リンパ球によるフォークヘッドボックスP3（FOXP3）発現、および癌細胞によるPDリガンド（L1）およびPD-L2発現を決定するために行われた。
結果： 10名の患者のうち、5名はエリブリンに対する応答者（部分応答）であり、5名は非応答者（安定した疾患、2;進行性の疾患、3）であった。治療後、PD-1、PD-L2、およびFOXP3の発現は5人の患者で陰性になり、PD-L1の発現は6人の患者で陰性になり、CD8の発現は3人の患者で陽性になった。エリブリンへの応答は、PD-L1およびFOXP3の負の変換とそれぞれ有意に関連していた（それぞれ、p = 0.024および0.004）。E-カドヘリン発現の変化（陽性または陰性）も、PD-L1およびFOXP3の変化と相関していた（それぞれ、p = 0.024および0.004）。ログランク検定を用いたカプランマイヤー分析により、PD-L1およびFOXP3が陰性の患者では無増悪生存期間と治療までの期間の失敗が有意に長いことが明らかになった（p = 0.012および0.001; p = 0.049および0.018）
結論： エリブリンの有効性は、上皮間葉移行抑制、および血管リモデリングと腫瘍微小環境の改善による免疫系への生物学的影響（PD-L1およびFOXP3発現の低下）に起因する可能性がある。

DOI： 10.21873/anticanres.12541

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Publishing type：Research paper (scientific journal)   International / domestic magazine：International journal  

背景：「免疫破壊を回避する」は最近、癌の特徴の1つとして確立された。プログラムされた細胞死（PD）-1 /プログラムされた細胞死リガンド（PD-L）1経路は、癌細胞が宿主の免疫を逃れることを可能にする重要な免疫抑制メカニズムである。本研究では、これらの免疫チェックポイントタンパク質の発現が乳癌のネオアジュバント化学療法（NAC）への反応にどのように影響したかを調査した。
方法： 切除可能な早期乳がんの合計177人の患者をNACで治療した。エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ヒト上皮成長因子受容体2、Ki67、PD-L1、PDL-2およびPD-1の状態を免疫組織化学によって評価した。
結果： PD-1の発現が高い患者は37人（20.9％）、PD-L1の発現が高い患者は42人（23.7％）、PD-L2の発現が高い患者は52人（29.4％）でした。PD-1およびPD-L1の発現が高い患者では、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）の発生率が有意に高かった（p = 0.041）（p <0.001）。TNBCでは、PD-1およびPD-L1の発現が高い患者の非pCR率が有意に高かった（p = 0.003）（p <0.001）。一変量分析では、PD-1およびPD-L1の発現もTNBCの無病生存期間を有意に短縮したことを示した（p = 0.048、HR = 3.318）（p = 0.007、HR = 8.375）。ただし、多変量解析では、PD-L1式のみが独立した予後因子であることがわかった（p = 0.041、HR = 9.479）。
結論：PD-1とPD-L1発現は、乳がんでNACへの処置反応を予測するバイオマーカーとして有効かもしない。とりわけ、PD-L1発現は、TNBCのより効果的化学療法のためのバイオマーカーとしても有効かもしれない。

DOI： 10.1186/s12967-018-1458-y

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Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

背景： トラスツズマブ、ペルツズマブ、ドセタキセル（TPDレジメン）による化学療法は、進行したヒト上皮成長因子受容体（HER）2陽性乳がんの第一選択療法の治療選択肢として強く推奨されている。この研究では、HER 1-4タンパク質の発現を分析し、それらの発現がTPDレジメンによる化学療法に対する進行したHER2陽性乳がんの反応を予測できるかどうかを調査した。
患者と方法： 2013年9月から2015年11月にTPDレジメン化学療法が実施された29例からなる研究である。エストロゲン受容体（ER）、プロゲステロン受容体（PgR）、Ki67、HER1、HER2、HER3およびHER4の発現レベル針生検標本を用いた免疫染色を使用して評価された。
結果： 全体的な奏効率（ORR）は、HER3陽性群の方がHER3陰性群よりも有意に高かった（p = 0.002）。予後分析では、HER3陽性グループはHER3陰性グループよりも有意な無増悪生存期間の延長を示した（p = 0.042、ログランク）。一変量解析では、客観的応答（p = 0.004、ハザード比（HR）= 0.123）と陽性のHER3発現（p = 0.023、HR = 0.279）が無増悪生存期間の延長に大きく貢献した。
結論： HER3発現は、TPDレジメンによる化学療法に対するHER2陽性乳がんの反応を予測するための有用な因子である可能性がある。

DOI： 10.21873/anticanres.12473

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Authorship：Lead author   Publishing type：Research paper (bulletin of university, research institution)   Kind of work：Single Work   International / domestic magazine：Domestic journal  

Publishing type：Research paper (scientific journal)  

Background: Chemotherapy with trastuzumab, pertuzumab and docetaxel (TPD regimen) is now strongly recommended as a treatment option for first-line therapy for advanced human epidermal growth factor receptor (HER)2positive breast cancer. In this study, we analyzed the expression of HER 1–4 proteins, and investigated whether or not their expression was predictive of the response of advanced HER2-positive breast cancer to chemotherapy with the TPD regimen. Patients and Methods: The study consisted of 29 cases in which TPD regimen chemotherapy was carried out from September 2013 to November 2015. The expression levels of estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PgR), Ki67, HER1, HER2, HER3 and HER4 were evaluated using immunostaining employing needle biopsy specimens. Results: The overall response rate (ORR) was significantly higher in the HER3-positive group than in the HER3-negative group (p=0.002). In prognostic analysis, the HER3-positive group showed a significant progression-free survival extension over the HER3-negative group (p=0.042, log-rank). In univariate analysis, objective response (p=0.004, hazard ratio(HR)=0.123) and positive HER3 expression (p=0.023, HR=0.279) significantly contributed to extension of progression-free survival interval. Conclusion: HER3 expression may be a useful factor for predicting the response of HER2-positive breast cancer to chemotherapy with the TPD regimen.

DOI： 10.21873/anticanres.12473

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Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

バックグラウンド： 最近、既存の病変による進行（PPL）と新しい転移による進行（PNM）の概念が治療抵抗性のがんの進行タイプを区別するために提案されてる。以前は、PPLとPNMの両方が固形腫瘍の反応評価基準（RECIST）の診断基準に基づいて進行性疾患として分類されているため、これら2つの進行タイプの違いは治療戦略の決定に影響しなかった。一方、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）は、がん宿主の免疫腫瘍微小環境（iTME）を監視するための指標として使用すると効果的であり、TILは予後と治療効果の予測におけるバイオマーカーとして重要な役割を果たす。この研究は、エリブリン化学療法を受けている患者の癌の進行タイプに焦点を当てた。
方法： エリブリンによる化学療法を受けた局所進行性または転移性乳癌の52人の患者のうち、40人が研究に残り、12人の患者がドロップアウト症例だった。抗腫瘍効果は、バージョン1.1を使用したRECIST基準に基づいて評価された。TILは、腫瘍間質内の浸潤リンパ球として定義され、調査したフィールドに比例して表現された。PPLの場合、高TILグループはタイプIと見なされ、低TILグループはタイプIIと分類された。PNM症例では、高TILグループはタイプIIIと見なされ、低TILグループはタイプIVと分類された。
結果： 19例では、タイプIの進行のある個人は、タイプIIIの進行のある個人と比較して、無増悪生存期間および全生存期間（OS）が有意に長かった（p = 0.040、p <0.001、ログランク）。I型に進行した人は、II型に進行した人と比較して、進行後の生存期間が有意に延長した（p = 0.048、ログランク）。OSの効果を検証する多変量解析では、これらが良好な予後の独立した因子であることを示した（p = 0.003;ハザード比[HR] = 0.065）（p = 0.006; HR = 0.105）。
結論： エリブリン化学療法の効果は、良好なiTMEで増殖する進行型乳がんの患者は予後が良好である可能性があることを示唆した。

DOI： 10.1186/s12967-018-1443-5

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Authorship：Lead author   Publishing type：Research paper (international conference proceedings)   Kind of work：Joint Work  

Mcl-1(骨髄細胞白血病1)遺伝子はホルボール12-ミリスチン酸塩13-アセテート(PMA)によってML-1骨髄白血病細胞の分化の際に発現する即初期遺伝子として最初に発見された。Mcl-1は、半減期の短いBcL-2ファミリーの抗アポトーシスタンパク質のメンバーである。我々は以前、ヒト好中球の自然アポトーシスがMcl-1の分解を伴うこと、また環状アデノシン一リン酸(cAMP)作用薬は、Mcl-1を安定化して好中球の自然アポトーシスを遅らせることを証明した。この研究において、我々はcAMP作用薬によるM cl-1の安定化の分子機構を検討した。腫瘍壊死因子-α(TNF-α)プラスシクロヘキシミド(CHX)(真核生物タンパク質合成抑制剤)によって誘導されるヒト胎児腎由来HEK293細胞のアポトーシスでは、Mcl-1の分解を伴うが、他の抗アポトーシスタンパク質(Bcl-2、BCL-XL)や抗アポトーシス(IAP)タンパク質ファミリー、cIAP1、cIAP2およびXIAPの分解は生じなかった。MG-132はTNF-αプラスCHX処置によるEK293細胞でのMcl-1の分解を抑制することから、Mcl-1の分解はプロテアソーム系を介することを示す。Mcl-1のプロテアソームでの分解は、そのリン酸化と以降のユビキチン結合によって制御されることが証明されている。ジブチリルcAMP(dB-cAMP)(サイクリックAMP依存性蛋白質リン酸化酵素(PKA)を刺激するcAMPの類似体)は、HEK293細胞のアポトーシスとTNF-αプラスCHX処置よって誘発されるMcl-1の分解を抑制した。さらに、PKA抑制剤H89はdB-cAMPのMcl-1分解に対する抑制効果をキャンセルした。したがって、PKAによるMcl-1リン酸化がTNF-αプラスCHX処置によって誘発されるMcl-1分解に関してcAMPの保護効果に関与していることを示唆する。ヒトMcl-1タンパク質がNetPhosKサーバーを用いたMcl-1アミノ酸配列の分析によって、我々はPKAでリン酸化される可能性があるサイトとして予測される4つのアミノ酸残基(S150、S159、S178とT266)が含まれることを明らかにした。さらに、さまざまな動物種からの複数のMcl-1のシーケンス配列は、4つのアミノ酸残基中3つが進化論的に保存されていることを明らかにした。ヒトMcl-1のさまざまなリン酸化部位変異体を用いたトランスフェクション実験により、セリン178がdB-cAMPのTNF-αプラスCHX処置よって誘発されたMcl-1分解に対する抑制効果のために重要なことを証明した。そのうえ、安定してヒトMcl-1の野生型、S178A、S178/3AとS178D変異体を発現しているHEK-293細胞を使った研究から、S178D変異体がTNF-αプラスCHX処置によるHEK293細胞のアポトーシスに対する抵抗性を付与することが分かった。結論として、セリン178はヒトMcl-1の安定化とcAMP作用薬によるHEK293細胞のTNF-αプラスCHXによって誘発されるアポトーシスの抑制のために重要である。

Publishing type：Research paper (scientific journal)  

CiNii Article

Publishing type：Research paper (international conference proceedings)  

Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

DOI： 10.1093/jb/mvt078

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Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

DOI： 10.7314/APJCP.2012.13.9.4827

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Authorship：Lead author   Publishing type：Research paper (scientific journal)   International / domestic magazine：International journal  

DOI： 10.1016/j.abb.2011.09.017

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Authorship：Lead author   Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

DOI： 10.1016/j.abb.2011.06.007

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Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

DOI： 10.1016/j.abb.2010.01.005

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Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

DOI： 10.1111/j.1365-2567.2008.03012.x

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Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

ヒト好中球では、プロテアソームを介したMcl-1とXリンクアポトーシスインヒビター（XIAP）の分解を伴った自発的なアポトーシスが起こる。カルパイン阻害剤（PD150606およびN-アセチル-Leu-Leu-Nle-CHO）は、自然好中球アポトーシスおよびMcl-1およびXIAPの分解を防止し、好中球に対するカルパイン阻害剤の効果はシクロヘキシミドに耐性であった。カルパイン阻害剤は、細胞内サイクリックAMPの増加を伴わないプロテインキナーゼA（PKA）の活性化を誘導した。カルパイン阻害を介した好中球アポトーシス遅延、Mcl-1とXIAPの安定化、およびPKA基質のリン酸化は、H-89（特定のPKA阻害剤）によって抑制された。これらの結果は、カルパイン抑制がサイクリックAMP非依存性のPKA活性化とPKAによって媒介されるMcl-1とXIAPの安定化を通して好中性アポトーシスを遅らせることを示唆する。

Publishing type：Research paper (scientific journal)  

Human neutrophils underwent spontaneous apoptosis, which was accompanied with proteasome-mediated degradation of Mcl-1 and X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP). Calpain inhibitors (PD150606 and N-acetyl-LeU-Leu-Nle-CHO) prevented spontaneous neutrophil apoptosis and degradation of Mcl-1 and XIAP, and the effects of calpain inhibitors on neutrophils were resistant to cycloheximide. Calpain inhibitors induced protein kinase A (PKA) activation, which was unaccompanied with an increase in intracellular cyclic AMP. Calpain inhibition-mediated delayed neutrophil apoptosis, stabilization of Mcl-1 and XIAP, and phosphorylation of PKA substrates were suppressed by H-89 (specific PKA inhibitor). These findings suggest that calpain inhibition delays neutrophil apoptosis via cyclic AMP-independent activation of PKA and PKA-mediated stabilization of Mcl-1 and XIAP. (C) 2008 Elsevier Inc. All rights reserved.

DOI： 10.1016/j.abb.2008.07.001

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Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

DOI： 10.1189/jlb.0907664

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Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

DOI： 10.1111/j.1365-2567.2007.02684.x

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DOI： 10.1038/ajh.2007.13

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上皮間葉転換（EMT）は、上皮細胞が線維芽細胞のような特性を獲得し、細胞接着の低下と運動性の増加を示す、発生および発癌中に発生するプロセスを表す。このレポートでは、ヒト乳腺上皮細胞株MCF10Aの小さな干渉（si）RNAゲルゾリンノックダウン細胞は典型的なEMTを示すことを明らかにした。EMTは線維芽細胞の形態、接触阻害の喪失、単層成長におけるフォーカス形成、in vitroでの運動性と侵襲性の強化、アクチンフィラメントの増加、RACの過剰発現、細胞外シグナル調節キナーゼとAKTの両方の活性化、グリコーゲンシンターゼキナーゼの不活性化、カドヘリンのEタイプからNタイプへの変換と転写因子Snailの誘導によって特徴付けられた。これらの結果は、ゲルソリンがSnailを通してＥ-とN-カドヘリン転換をコントロールするスイッチとして機能することを示唆し、そのノックダウンがヒト乳腺上皮細胞のEMT、およびヒト乳癌の進展につながることを示した。

DOI： 10.1002/ijc.21559

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我々は以前にインターフェロンアルファ（IFNalpha）がアポトーシスを誘導し、EGFが人間の類表皮癌KB細胞におけるこの効果に拮抗できることを報告した。アポトーシスは細胞骨格の再編成と共に発生するため、IFNalphaとEGFが実験条件で細胞リモデリングを調節できるかどうかを評価した。我々は、48時間1,000 IU / ml IFNalphaがストレスファイバーの構造的再編成と膜非局在化、およびアクチン切断タンパク質ゲルゾリンの部分的なキャッピングを誘導することを発見した。野生型（WT）またはゲルソリンのC末端短縮型の両方によるKB細胞のトランスフェクションは、タンパク質の過剰発現と、自発的およびIFNalpha誘導性のアポトーシスと細胞骨格変化の両方の増加を引き起こした。実際には、48時間の処理後、IFNalphaは親細胞で45％のアポトーシス細胞死を誘導したが、約80％はトランスフェクトされた細胞でアポトーシスを起こした。これらの影響は、ゲルゾリンの発現増加および結果として生じるゲルゾリンの分解とともに発生した。この場合も、IFNalphaで処理したトランスフェクト細胞にEGFを添加するとアポトーシスが回復した。特に、IFNalphaとEGFは、接着斑キナーゼやビンキュリンなどの細胞骨格に関連する他の分子の発現を変化させなかった。同じ実験条件で、IFNalphaは、カスパーゼ3の活性化とチトクロームcのリリースと共に発生したゲルゾリンの切断も誘発した。これらすべての影響は、IFNalpha処理KBを過去12時間10 nM EGFに曝露することで拮抗された。また、20 microM DEVDによるカスパーゼ3の特異的阻害は、IFNalphaによって誘導されるアポトーシスとゲルゾリン切断を完全に無効にした。結論として、我々のデータは、IFNalphaが、カスパーゼ3を介したゲルゾリンの切断を介して、アポトーシスの開始に特有の形態学的細胞変化を誘発できるという最初の実証で。さらに、EGFがカスパーゼ3の活性化を阻害することにより、これらの影響に拮抗できることを示した。

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隣接する心筋細胞によって構成されるギャップ結合（GJ）は、イオンと小分子をゲーティングして心臓の収縮を調整するために不可欠である。cAMPはGJ機能の強化のための強力な刺激であることが示唆されている。ただし、cAMPが心筋細胞のGJを増強する方法はとらえどころのないままである。ここでは、GJのゲート機能がプロテインキナーゼA（PKA）依存信号によって強化され、筋細胞で最も豊富なCxであるコネキシン43（Cx43）の蓄積が、cAMPによって直接活性化される交換タンパク質（Epac）（Rap1アクティベーター）依存信号によって強化されることを示した。GJのゲーティング機能は、マイクロインジェクション色素移入法によって分析した。Cx43の蓄積を定量的免疫染色で分析しました。PKA固有のアクティベーターN6-ベンゾイルアデノシン-3 '、5'-環状一リン酸（6Bnz）とEpac固有の活性化因子8-（4-クロロフェニルチオ）-2'-O-メチルアデノシン-3 '、5'-環状一リン酸（8CPT）の使用によって強化されたGJ新生に関与するcAMPの2つの重要なダウンストリーム信号を区別できる。6BnzはGJのゲーティング機能を細胞間接触でのCx43のわずかな蓄積で増強したが、8CPTはゲートへのわずかな影響でCx43の蓄積を著しく強化した。さらに、神経カドヘリン免疫染色の増加によって特徴付けられるように、接着結合（AJ）が8CPTによって成熟していることも明らかになった。AJ形成はGJ形成に先行するため、Epac-Rap1信号によって加速されたAJ形成は、GJ形成の増強をもたらす可能性がある。GJ新生におけるEpac-Rap1信号の関与は、Rap1GAP1bの過剰発現によるRap1の不活性化が細胞間接触でのCx43の蓄積を混乱させたという証拠によってさらに確認された。したがって、PKAとEpacは協調して心筋細胞の機能的なGJ新生を強化する。

DOI： 10.1161/01.RES.0000183880.49270.f9

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アミロイドベータ（Aベータ）ペプチドは、アルツハイマー病の発症において中心的な役割を果たす。それらはミトコンドリア機能障害とカスパーゼ活性化を誘発し、神経細胞のアポトーシスを引き起こすことが知られている。ここでは、ヒト細胞質ゲルゾリンが、神経細胞に分化したラットの褐色細胞腫（PC-12）細胞でのAベータペプチドによる細胞死を阻害することを示す。また、ヒト細胞質ゲルゾリンセグメント5ではなく6がAベータによる細胞毒性の抑制に責任がある重要な領域であることを示す。細胞死、膜電位損失、チトクロームcの放出に関連するミトコンドリア機能障害は、すべてヒト細胞質ゲルゾリン全長またはセグメント5の存在下で無効になる。さらに、PC-12細胞における内因性ゲルゾリンの発現を減少させるRNA干渉は、ラットゲルゾリンがAベータ細胞毒性の阻害剤として作用することを示す。これらの結果は、細胞質ゲルゾリンがアポトーシスのミトコンドリアの変化を阻害することにより、安部田誘発性細胞毒性を阻害する上で重要な役割を果たすことを示す。機能にはヒト細胞質ゲルゾリンのセグメント5で十分である。

DOI： 10.1016/j.neurobiolaging.2004.08.003

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内皮細胞の遊走は化学誘引物質によって促進され、先端に向かって微小管の伸長が伴う。細胞骨格微小管は分極し、細胞遊走中にモータータンパク質によってさまざまな分子を送達するためのレールとして機能する。しかし、微小管の分極伸長による方向性移動がどのように制御されているかは不明である。ここでは、Rap1が血管内皮細胞の移動を制御することを報告する。我々は、Rap1関連分子であるRAPLが微小管に局在し、Rasアソシエーションドメインファミリー（Rassf）に属すること、およびRap1が微小管からのRAPLの解離を誘導することを発見した。蛍光共鳴エネルギー移動に基づくRap1活性化モニタリングプローブにより、局所的なRap1活性化が2種類の細胞遊走、走化性および創傷治癒下の細胞の前縁で発生することを実証した。強化された緑色蛍光タンパク質-RAPLによってマークされた微小管のタイムラプスイメージングは、移動する細胞の前縁に向かって微小管の方向性成長を示した。アデノウイルスを使用して、rap1GAPIIの発現によるRap1の不活化は、創傷治癒を阻害した。さらに、RAPL変異体の発現によるRap1およびRAPLの切断も創傷治癒を混乱させた。以上の結果は、局所的に活性化されたRap1とRAPLとの結合は、血管内皮細胞の方向性のある移動を制御する。

DOI： 10.1074/jbc.M409701200

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以前に、ゲルゾリン遺伝子の発現がさまざまな腫瘍で減少することを報告した。腫瘍におけるゲルゾリンのダウンレギュレーションのメカニズムをさらに解析するために、膀胱癌細胞株におけるゲルゾリンプロモーターのin vivoでの特徴を調べた。プロモーターの突然変異も高メチル化も遺伝子サイレンシングの原因ではなかった。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤トリコスタチンA（TSA）処理後、ゲルゾリンプロモーター活性は、正常組織に由来する細胞ではなく、癌細胞で著しく増強された。クロマチン免疫沈降アッセイにより、ヒストンH3とH4の両方が癌細胞のプロモーター領域で低アセチル化され、アセチル化ヒストンの蓄積がTSA処理によって検出されたことが明らかになった。In vivoフットプリンティング分析により、-35ヌクレオチド周囲の非翻訳領域にジメチル硫酸（DMS）過敏性部位の存在が正常な組織に由来する細胞ではなく、癌細胞でのみ明らかになった。KMnO4反応性ヌクレオチドの分析は、癌細胞内でステムループ構造が形成される可能であることを示した。この新しいステムループ構造は、癌細胞におけるゲルゾリン遺伝子の転写の調節に役割を果たす可能性がある。これらの結果は、プロモーター領域のヒストン脱アセチル化と構造変化（DMS過敏症とステムループ構造）によるヌクレオソームのアクセシビリティが、ヒト膀胱癌のゲルゾリン遺伝子のサイレンシングにつながるメカニズムの基礎を形成していることを示唆する。

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ゲルゾリンの発現は、肺癌およびいくつかのタイプの異なるヒトの癌で頻繁にダウンレギュレートされている。腫瘍形成性に対するゲルゾリン発現回復の影響を調べるために、ここでは、肺癌細胞（扁平上皮癌、PC10）への遺伝子導入を介して、ゲルゾリンをさまざまなレベルで安定して発現させた。ヌードマウスに接種しin vivoでの腫瘍原性の変化とin vitroでの成長特性の変化を観察した。親細胞および対照クローンと比較して、ゲルゾリントランスフェクタントでは腫瘍形成性が非常に低下し、細胞増殖を抑制した。さらに、ホスホリパーゼC（PLC）/プロテインキナーゼC（PKC）シグナル伝達経路のアゴニスト刺激活性化は細胞増殖と腫瘍形成に重要であるため、ゲルゾリン過剰発現クローンにおけるブラジキニン誘発応答を解析した。ブラジキニンは、PLCによるホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸（PIP2）の加水分解および細胞質画分から粒子状画分へのさまざまなPKCアイソフォームの移行を促進する。ブラジキニン処理によりゲルゾリントランスフェクタントでイノシトール三リン酸（IP3）の生産は増加せず、PKCαとPKCγの膜画分への移行を誘導しなかったが、親株とコントロールのクローンでは、PIP2加水分解を誘発し、PKCαとPKCγの膜画分を増加させた。これらの結果は、ゲルゾリンがリン脂質シグナル伝達経路に関与するPKCの活性化を抑制し、細胞増殖と腫瘍形成性を阻害したことを示唆する。

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抗ゲルゾリン抗体を用いたウエスタンブロット分析による38のヒトメラノーマサンプルの解析により、野生型ゲルゾリンと共発現する新しい85 kDaのトランケートされたゲルゾリン（GSNp85）が、垂直成長期のメラノーマ（クラークレベルII-IV）および転移性増殖期の黒色腫で頻繁に発現することが示された。GSNp85トランケートは放射状成長期黒色腫（クラークレベルI）、後天性母斑、他の皮膚癌または正常な皮膚組織では発現ていなかった。ペプチドシーケンス分析により、GSNp85にはカスパーゼ8認識サイトIETDを含む領域に野生型ゲルゾリンのC末端ドメインがないことが明らかになった。カスパーゼ8の切断はGSNp85陽性で検出されたが、GSNp85陰性メラノーマでは検出されなかった。これらのデータは、GSNp85がカスパーゼ-8の分解産物で悪性黒色腫の垂直成長期あるいは転移の新しい指標として有効かもしれないことを示唆する。

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目的： ゲルゾリンは、正常な上皮細胞と比較してヒトの膀胱腫瘍では検出されない、または減少するアクチン調節タンパク質である。ゲルソリンの過剰発現が腫瘍の成長を阻害できるかどうかを、野生型ゲルゾリン（Ad-GSN）をコードする組換えアデノウイルスを使用して同所性膀胱癌ヌードマウスモデルで解析した。
材料と方法： 2つのひと膀胱癌細胞株KU-7とUMUC-2にin vitroでAd-GSNを形質導入した。アデノウイルスを形質導入した後の細胞周期を調べるためにフローサイトメトリー分析を行った。細胞の成長は、大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子Ad-betagalを含むアデノウイルスで形質導入されたこれらの細胞の対照群と比較さした。In vivo KU-7細胞をヌードマウスの膀胱に導入し（0日目）、尿道に3回注射（2〜4日目）し、Ad-GSNまたはAd-betagal（1 x 10 pfu）を注入した。最初のアデノウイルス曝露から8日後（10日目）、各膀胱の切片を作成して染色し、腫瘍の腫瘤をデジタルで測定した。
結果： 膀胱癌細胞の成長（KU-7およびUMUC-2）は、これらの細胞にインビトロでAd-GSNが導入された後に阻害された。ゲルソリンの発現に対するフローサイトメトリー分析に基づいて、これらの細胞が細胞周期のG2 / M期で停止または遅延する可能性がある。同所性膀胱癌モデルでは、Ad-GSN処理された動物では、対照群よりも腫瘍の質量が約90％少なかった。
結論： Ad-GSNは、この同所性ヌードマウスモデルにおいてヒト膀胱癌細胞に有意な腫瘍抑制効果をもたらす。ゲルソリンの過剰発現が媒介するアデノウイルスはヒト膀胱癌の有用な治療法となり得る。

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ディファレンシャルディスプレイ法を使用して、クローン性の弱い腫瘍形成性で非転移性のQR-32細胞に由来する悪性マウス線維肉腫細胞（QRsP-30）のチモシン-beta4遺伝子の過剰発現を特定した。チモシン-beta4はG-アクチンと相互作用して、細胞内の主要なアクチン隔離タンパク質として機能する4.9kdのポリペプチドとして知られている。QR-32細胞から独立して変換された6つの悪性線維肉腫細胞株はすべて、高レベルのチモシン-beta4 mRNAを発現し、腫瘍細胞におけるその発現は、腫瘍形成性および転移能と相関していた。チモシン-beta4 cDNAでトランスフェクトされたQR-32細胞（32-S）でのチモシン-beta4のアップレギュレーションは、細胞を変換して腫瘍を発生させ、同系のC57BL / 6マウスに多数の肺転移を形成した。対照的に、アンチセンスチモシン-beta4 cDNAトランスフェクトQRsP-30（30-AS）細胞は、チモシン-beta4発現を減少させ、腫瘍形成と遠隔臓器への転移を大幅に減少した。ベクターのみのトランスフェクト細胞（32 Vまたは30 V細胞）は、親細胞のように機能した。腫瘍細胞の運動性、細胞形状、およびF-アクチン組織がチモシン-beta4発現のレベルに比例して調節されていることを観察した。これらの結果は、チモシン-beta4分子が線維肉腫細胞の腫瘍原性と転移をアクチンベースの細胞骨格組織を介して調節することを示す。Fアクチン組織はチモシン-beta4発現のレベルに比例して規制されている。これらの結果は、チモシン-beta4分子が線維肉腫細胞の腫瘍原性と転移をアクチンベースの細胞骨格組織を介して調節することを示す。

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アクチン結合タンパク質であるゲルゾリンは、細胞運動の重要な調節因子として関与している。さらに、ゲルゾリンの細胞レベルがさまざまな腫瘍細胞で減少し、遺伝子導入によるゲルゾリンの過剰発現が腫瘍形成性を抑制することを報告した。転移に対するゲルゾリンの過剰発現の影響を評価し、その過剰発現の影響についてゲルゾリンにCa（2+）依存性を与えるカルボキシル末端の重要性を決定しようとした。Ras形質転換細胞の扁平復帰変異体から単離された完全長の野生型またはHis321変異型のいずれかをコードするcDNAと、カルボキシル末端トランケートであるゲルゾリンのC-delを含む発現ベクターを、高度に転移性のマウスメラノーマ細胞株B16-BL6にトランスフェクトした。導入されたcDNAのトランスフェクタントでの発現は、ウエスタンブロッティング、2次元ゲル電気泳動および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を使用して確認した。成長率、軟寒天でのコロニー形成、細胞運動性、in vivo転移形成などの形質転換体の表現型を解析した。野生型、His321変異体、C-delゲルゾリンを発現するトランスフェクタントは、軟寒天での増殖能の低下を示した。トランスフェクタントの細胞表面でのインテグリンbeta1またはalpha4の発現は変化しなかったが、野生型およびHis321変異ゲルゾリンは、C-delゲルゾリンを除いて、細胞スプレディングの遅延、フィブロネクチンへの化学遊走性が減少し、自然転移における肺コロニー形成を抑制した。ゲルゾリンは、転移抑制因子および腫瘍抑制因子遺伝子として機能する可能性があり、ゲルソリンのカルボキシル末端は、細胞スプレディングを遅らせるために重要である。

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ゲルソリンは、アクチンの重合－脱重合を調節するCa2+依存性のアクチン調節タンパク質であり、アクチンネットワークの調節を通じて細胞運動を調節すると考えられている。ゲルゾリンはまた、アポトーシスの調節に関与することが最近示唆された：ヒトのゲルゾリン（hGsn）は抗アポトーシス活性を持っているが、マウスのゲルゾリン（mGsn）は、異なる細胞タイプに応じてアポトーシスまたは抗アポトーシス活性を発揮する。ここでは、hGsnの抗アポトーシス活性の基礎を研究した。内因性と過剰発現の両方のhGsnがそのC末端の半分に依存する抗アポトーシス活性を持っていることを示した。また、mGsn ではなく、hGsnとそのC末端の半分が、Bcl-xLと同様の程度に、Apsiの消失や分離したミトコンドリアでのチトクロームcの放出などアポトーシスでのミトコンドリアの変化を防ぐことが明らかとなった。hGsnがミトコンドリアを標的にして、そのC末端半分を介してアポトーシスを防ぐことを示す。抗アポトーシスBcl-xLと同じように、電位依存性陰イオンチャネル（VDAC）を結合して閉じることにより、アポトーシスでのミトコンドリアの変化を防ぐことが明らかとなった。hGsnとそのC末端の半分は、Ca2+依存的に直接結合することで、リポソーム上のVDACの活性を阻害した。これらの結果は、hGsnがミトコンドリアのVDAC活性をブロックすることによりアポトーシスを阻害することを示唆する。

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クロマチン凝縮、核断片化、細胞膜ブレブ、およびアポトーシス体形成を特徴とするアポトーシス細胞死も典型的なミトコンドリアの変化を伴う。後者には、膜透過性の亢進、ミトコンドリア膜電位（Deltapsi（m））の低下およびサイトゾルへのチトクロームcの放出が含まれまる。アクチン調節タンパク質であるゲルゾリンはアポトーシスを阻害することが示されているが、カスパーゼ3によって切断されると、アポトーシスのエフェクターとして関与するフラグメントが生成される。ゲルゾリンの全長型がアポトーシスを阻害するメカニズムは不明である。ここでは、gelsolinの過剰発現がDeltapsi（m）の消失とミトコンドリアからのチトクロームcの放出を阻害し、スタウロスポリン、タプシガルギン、およびプロトポルフィリンIXで処理されたJurkat細胞でカスパーゼ-3、-8、および-9の活性化が失われることを示す。これらの効果は、組換えゲルゾリンタンパク質を使用してin vitroでCa(2+）、atractyloside、またはBaxで刺激した分離ラットミトコンドリアで確認された。このゲルゾリンの保護機能は単純なCa(2+）の除去のためではなく、またポリホスホイノシチド結合によって阻害された。さらに、細胞質ゾルでの局在に加えて、ゲルゾリンが細胞のミトコンドリア画分にも存在することを確認した。したがって、ゲルソリンは、ミトコンドリアのレベルでのアポトーシスのシグナル伝達の初期段階に作用する。

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膵臓癌では、c-K-rasの変異は腫瘍の成長と転移の重要なイベントである。我々は以前に、膵臓癌細胞の成長に対するN116Yのドミナントネガティブ効果を実証した。膵臓腫瘍細胞の転移性増殖を抑制するためのN116Yの可能性を評価するために、癌胎児性抗原（CEA）プロモーター（Ad CEA-N116Y）によって駆動される複製欠損組換えN116Yアデノウイルスを作成した。Ad CEA-N116Y感染後でN116Yの発現、成長阻害、アポトーシス死誘導はすべてプロモーター陽性の膵臓癌細胞株（PCI-35およびPCI-43）に特異的であるのに対し、ヒト胚性膵臓由来細胞株1C3D3では成長遅延は観察されなかった。ヌードマウスの脾臓への腫瘍接種で生成された肝臓でのPCI-43コロニーの転移性増殖に対するAd CEA-N116Yの効果を調べた。その結果、腫瘍細胞接種の5日後にAd CEA-N116Yを脾臓内に注射することで合併症なしに転移性コロニーの数を効果的に減少させることを示した。したがって、N116YはCEAプロモーター駆動型のアデノウイルスベクターを使用することにより、膵臓腫瘍細胞の転移性増殖を選択的に抑制でき、N116Y遺伝子治療が肝微小転移を伴う膵臓癌患者の治療に潜在的に役立つ可能性があることを示す。

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アクチン結合タンパク質であるゲルゾリンは、ホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸（PIP（2））に結合する強力な能力を示す。ここでは、in vitroの実験でゲルゾリンが組換えホスホリパーゼD1（PLD1）とPLD2の活性を阻害したが、オレイン酸依存性PLDは阻害しなかったこと、およびこの阻害はPIP（2）濃度の増加によって解除されなかったことを示した。アゴニストを介したPLD活性化におけるゲルゾリンの役割を解析するために、ヒト細胞質ゲルゾリンのcDNAを安定的にトランスフェクトしたNIH 3T3線維芽細胞を使用した。ゲルソリンの過剰発現は、ブラジキニン誘発ホスホリパーゼC（PLC）とPLDの活性化を抑制した。一方、スフィンゴシン1-リン酸（S1P）によって誘発されたPLDの活性化は、ゲルゾリンの過剰発現によって変化しなかったが、PLCの活性化は抑制された。ホルボールミリステートアセテートまたはCa（2+）イオノフォアA23187によるPLDの活性化は、ゲルゾリンの過剰発現の影響を受けなかった。コントロール細胞においてブラジキニンまたはS1Pのいずれかの刺激は、タンパク質キナーゼC（PKC）の膜への移行を引き起こした。PKC-alphaおよびPKC-beta1の膜移行は、ゲルゾリン過剰発現細胞では減少したが、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼのリン酸化は変化しなかった。S1P誘発のPLC活性化とマイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化は百日咳毒素に感受性であったが、PLD応答はそのような処理に非感受性で、S1PがPLCとマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路に関与するG(i)とは異なる特定のGタンパク質を介してPLD活性化を誘発したことを示唆する。

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我々は以前に、ヒトの胃（TMK1）および膀胱（UMUC2）の癌細胞株でアクチン調節タンパク質であるゲルゾリンの発現が著しく低下していることを報告している[S. Moriya et al。、（1994）、Int。J.オンコル。5、1347-1351、M. Tanaka et al。（1995）、Cancer Res。55、3228-3232]。ゲルゾリンの発現がトランスフェクションによって回復すると、癌細胞はin vivoで腫瘍形成性を失った[M. 田中ほか （1995）、Cancer Res。55、3228-3232]。ここでは、TMS1とUMUC2のゲルゾリン過剰発現細胞がUVC照射に対してより耐性であることを示す。耐性の増加は、同様に処理された対照ネオトランスフェクタントと比較して、細胞周期のG2期にある細胞の割合の増加に関連している。細胞周期分析により決定されたように、UVC照射後、同期化されたゲルゾリン過剰発現UMUC2細胞は、コントロールのトランスフェクトされたUMUC2細胞と比較して遅延されたG2期の蓄積に続きS期が延長した。ゲルゾリントランスフェクタントでのサイクリンB1とcdk1ヒストンH1キナーゼ活性のレベルは、Sおよび初期G2の段階で低いままで、UVCによって誘発されるジアシルグリセロールの生成は、ネオトランスフェクタントと比較してゲルゾリントランスフェクタントで減少した。これらの結果は、ゲルゾリンが脂質代謝を通じて細胞のG2期チェックポイント機能を高め、UVC耐性につながることを示唆する。放射線染色体異常誘発および化学発癌が細胞周期依存性であるという最近の証拠と併せて考えるとゲルゾリンのダウンレギュレーションは、G2期チェックポイント機能を弱めることにより、ヒトの胃癌または膀胱癌の悪性転換につながる可能性がある。

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ゲルゾリンは、ほとんどの脊椎動物の組織に存在する82-kDのタンパク質で、in vitroでアクチンポリマーの長さに影響を与えることが示されている。ゲルソリンは、アクチンフィラメントを切断し、アクチン重合を核形成し、アクチンフィラメントの急速に成長する（半矢じり末端）のアクチンモノマー交換をブロックする。カルシウムイオン、pH、およびポリホスホイノシチドは、in vitroでこれらの活動を調節する。ゲルゾリンcDNAの安定したトランスフェクションにより線維芽細胞におけるゲルゾリンの発現が増加すると、組織培養で細胞が急速に移動する。また、ゲルゾリン欠失マウス由来の成人皮膚線維芽細胞は、遅く移動し野生型線維芽細胞と比較して波打ち膜を減少させた。ゲルゾリン分子のアミノ酸配列には6つの相同反復（G1からG6）があり、ゲルゾリンのタンパク質分解フラグメントと組換えトランケートを使用した広範な研究は、ゲルソリンのさまざまな機能が反復配列によってコードされるドメインの協調的相互作用を含むことを示す。G1ドメインは切断活性に不可欠であるとことから、G1はゲルゾリンの切断活動のエフェクタードメインと見なされている。通常、機能ドメインが欠けている変異タンパク質は天然タンパク質の活性を阻害するために使用できる。以前に、切断に必要なG1ドメインを欠いているが、フィラメント結合やモノマー核形成できるゲルゾリンのトランケートG2-6とG2-3は、ネイティブなゲルゾリンあるいはアクチンフィラメントのリモデリングに影響を与える別のタンパク質ファミリー、コフィリンのアクチンフィラメント切断活性の競合阻害剤として機能することを示した。この研究では、細胞内での効果を調べるために、ゲルゾリンのトランケートをコードするcDNAをトランスフェクトした。

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カスパーゼ-3のベイトプラスミドを使用してマウス胚cDNA発現ライブラリーをスクリーニングした後、カスパーゼ-3に結合するタンパク質をコードする13のクローンを得た、その結果、アポトーシスに関与するアクチン調節タンパク質であるゲルゾリンを含む10個のクローンが、組換えカスパーゼ-3によってインビトロで切断されたことを示した。同じベイトを使用して、ヒトの胸腺cDNA発現ライブラリーからヒトのゲルゾリンcDNAも単離した。ヒトのゲルゾリンがin vivoでのFasを介したアポトーシス中に切断されたことと、ヒトのゲルゾリンのカスパーゼ3切断部位がDQTD352GのD352にあることを示した。さらに、ゲルゾリン（以前に報告）の抗アポトーシス活性はミトコンドリアからサイトゾルへのチトクロームc放出につながるステップの阻害であると考えられた。我々のの結果は、このクローニング法がカスパーゼの基質とおそらく他の酵素の基質の同定にも役立つことを示す。

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ほとんどの肺癌と膀胱癌は喫煙に関連していることが示されています。我々は以前に、膀胱癌における頻繁なゲルゾリン発現の喪失およびその腫瘍抑制活性を実証した（M. Tanaka et al。、Cancer Res。、55：3228-3232、1995）。ここでは、12の培養非小細胞肺癌（NSCLC）細胞株におけるゲルゾリン発現を調べた。さらに、88の外科的に切除されたNSCLCで患者の喫煙習慣に関連してゲルゾリンの発現を分析し、ゲルゾリンが肺がんのタバコ誘発性発癌の分子標的であるかどうかを調査した。ノーザンブロット分析により、12のNSCLC細胞株のすべてにおいて、正常な肺組織と比較して、ゲルゾリン遺伝子の発現は低いか検出不能であることを示した。一方、ゲノムDNAのサザンブロット分析では、NSCLC細胞株における遺伝子の全体的な再構成や欠失は認められなかった。ウエスタンブロット分析では、正常な肺組織と比較して、12のNSCLC細胞株すべてでゲルゾリン発現は低いか検出不能であった。NSCLC細胞株におけるゲルゾリン発現の免疫細胞化学分析は、陽性対照として正常な気管支上皮細胞を使用したウエスタンブロット分析によって得られた結果と一致した。免疫組織化学によって外科的に切除されたNSCLCで、ゲルソリンの発現を分析したところ、88例中48例（55％）の切除されたNSCLCでゲルゾリン発現が減少、または検出できなかった。このようなゲルゾリン発現変化は、患者の大量喫煙と有意に相関した。一方、ゲルゾリン発現と組織型、病理学的腫瘍結節転移（pTNM）ステージ、または生存率には有意な相関はなかった。これらの発見は、ゲルゾリン発現の頻繁な喪失が、NSCLCの発生においてタバコ誘発性発癌の潜在的な分子標的としての関与している可能性を示唆する。

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ゲルソリンは、6つのサブドメインを持つカルシウム活性化アクチン結合タンパク質である。N末端（G1）ドメインはアクチンフィラメント切断活性に不可欠であり、一方でG2-3内の他のドメインがタンパク質をフィラメント側に配置してG1が切断できるようにする。内因性ゲルゾリンと、場合によっては他のアクチンフィラメント調節タンパク質を競合的に阻害できる試薬を作製するために、大腸菌でゲルゾリンのいくつかのトランケートを発現し、2つの異なるアクチン結合タンパク質、ゲルゾリンとコフィリンのインビトロでの活性に影響するかどうかを検討した。G2-3トランケートはあまり効果的ではなかったが、G2-6を含むCa2 +感受性トランケートはゲルゾリンとコフィリンの両方のF-アクチン脱重合活性を阻害した。2つの独立したアッセイによる我々の結果は、ゲルソリンのトランケートがアクチンフィラメントの切断を阻害し、アクチンサブユニットの解離速度に著しく影響しないという考えを裏付けている。カルシウム存在下での沈降分析は、G2-6トランケートがG2-3トランケートよりもF-アクチンに強く結合することを示し、Fアクチンのコンフォメーション変化および/またはアクチンフィラメント結合ドメインの存在に依存するアクチンフィラメントへの競合的結合による保護メカニズムと一致する。

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ゲルソリンは、アクチンの重合と脱重合を調節するアクチン調節タンパク質であり、アクチンネットワークの調節を通じて生体内で細胞運動を調節すると考えられている。そのアクチン調節機能に加えて、ゲルゾリンは細胞増殖に影響を与えることも提案されている。我々の現在の実験は、増殖によって著しく影響を受けるアポトーシスの調節におけるゲルゾリンの関与可能性を検討した。Jurkat細胞でゲルゾリンを過剰発現すると、F-アクチンの形態やFasまたはBcl-2ファミリータンパク質のレベルを変化させることなく、抗Fas抗体、C2-セラミドまたはデキサメタゾンによって誘発されるアポトーシスを強く抑制した。アポトーシスが誘導されると、コントロールベクタートランスフェクタントではCPP32（-like）プロテアーゼ活性の増加が観察されたが、ゲルゾリントランスフェクタントでは強く抑制されていた。CPP32プロテアーゼの不活性型であるPro-CPP32タンパク質は、ゲルゾリントランスフェクタントでの抗Fas抗体処理によって切断されずに残ったため、ゲルソリンがこのプロテアーゼの上流をブロックしていることが示唆される。CPP32（-like）プロテアーゼのテトラペプチド阻害剤は、Fasを介したアポトーシスを強く阻害したがC2セラミドとデキサメタゾンによって誘導されるアポトーシスの両方を部分的にしか抑制しなかった。これらのデータは、アポトーシスの実行に関与する重要なターゲットがJurkat細胞のCPP32（-like）プロテアーゼの上流に存在する可能性があり、ゲルゾリンがこのターゲットに作用してアポトーシス細胞死プログラムを阻害することを示唆する。

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栄養膜細胞系統におけるras遺伝子の役割を調査するために、我々はウイルスH-またはK-ras癌遺伝子をヒト絨毛癌細胞株、CCIにトランスフェクトし、活性化ras癌遺伝子を発現するCCI細胞の生物学的特性を分析した。すべてのv-H-ras発現クローンは、半球形ドームを明確に形成した。これは、ベクトル輸送機能のin vitro形態学的発現を表し、分極した上皮細胞に特徴的で、v-K-ras発現クローンおよびコントロールクローンでは認められなかった。顕微鏡観察により、それらのドームは細胞層と培養皿表面との間に蓄積した流体で満たされた空洞であることが示された。走査型電子顕微鏡により、ドームは長い多数の微絨毛を有する丸い細胞の集合体であり、形態学的に胚盤胞に類似していたことが明らかになった。さらに、上皮細胞の輸送におけるベクトル液輸送に関連するNa（+）-K（+）-ATPase活性は、v-K-ras発現クローンや親細胞よりもv-H-ras発現クローンで有意に高かった。これらのドームは、Na（+）-K（+）-ATPase特異的阻害剤であるウアベイン処理後24時間以内に平らになり、ドームの数は用量依存的に減少したことから、ドームの維持にはNa（+）-K（+）-ATPase活性が必要であった。これらの結果は、K-rasではなくアップレギュレートされたH-rasの活性が絨毛膜細胞層を介したベクトル液輸送を促進し、ドーム形成につながることを示唆している。

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我々は先にアクチン制御タンパク質ゲルソリンがヒト胃癌細胞や膀胱癌において腫瘍抑制能を有することを報告した。我々の今回の実験で、ノーザンブロット法およびウエスタンブロット法によってヒトの大腸癌細胞株および大腸癌組織においてゲルソリン発現を検討した。ウエスタンブロット解析により、7大腸癌細胞株の内4株、また15の大腸癌組織中9組織で正常大腸上皮細胞と比較して、ゲルソリンの発現が低下していることが明らかになった。さらに、ヒト正常ゲルソリンcDNAをヒト大腸癌細胞株LoVoに導入したところゲルソリン導入細胞でコロニー形成能および造腫瘍性が減弱した。これらの結果から、ゲルソリンはヒトのさまざまな腫瘍で発がんにおける腫瘍抑制遺伝子として重要な役割を果たすことが確認された。

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膀胱のヒト移行上皮癌では、膀胱発癌の初期段階でさえ、染色体9p12と9qterの間の範囲にわたる染色体異常を頻繁に生じる。アクチン調節タンパク質であるゲルゾリンをコードする遺伝子は染色体9q33に局在しているため、多くのヒト膀胱癌細胞株および膀胱癌組織におけるゲルゾリンの発現を調べた。6つの細胞株すべてと18の腫瘍組織のうち14（77.8％）で、正常な膀胱上皮細胞での発現と比較して、ゲルゾリンの発現は検出されないか、非常に低下していた。さらに、外因性のヒトまたはマウスの正常ゲルゾリンcDNAをヒト膀胱癌細胞株UMUC-2に導入すると、UMUC-2のゲルゾリントランスフェクタントでは、in vivoでコロニー形成能と腫瘍形成能が大幅に低下していた。

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変異ゲルゾリン[His321]ゲルゾリンは、エチルメタンスルホネート処理により生成されたヒト活性化c-Ha-ras癌遺伝子形質転換NIH / 3T3細胞（EJ-NIH / 3T3）の平らな復帰変異体であるR1から単離された。[His321]ゲルゾリンは321残基のプロリン残基がヒスチジンに置換しており、構成的に発現するとEJ-NIH / 3T3細胞の腫瘍原性を抑制する[ミュラウアー、L、藤田、H、石崎、A＆葛巻、N（1993）Oncogene 8、2531-2536]。His321のアミノ酸置換の生化学的影響を調査するために、[His321]ゲルゾリンと野生型ゲルゾリンを大腸菌で発現させ、精製して、アクチン、ポリホスホイノシトール脂質、およびホスホリパーゼCへの影響を分析した。[His321]ゲルゾリンではインビトロで野生型ゲルゾリンと比較して、アクチンフィラメント切断活性が低下し、核形成活性は増加している。さらに、野生型ゲルゾリンと比較して、[His321]ゲルゾリンによる核形成と切断の両方が、ホスホイノシトール脂質であるホスファチジルイノシトール4-リン酸（PtdInsP）とホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸（PtdInsP2）により強く阻害される。さらに、[His321]ゲルゾリンは、ホスホイノシトール脂質に対する結合能力が高いため、ホスホリパーゼCγ1によるPtdInsP2加水分解を野生型ゲルゾリンよりもin vitroで強く阻害する。ゲルソリンには、S1-S6と呼ばれる6つの相同アミノ酸反復がある。私たちの結果は、関連するアクチン結合ドメインがセグメント1、2および4-6にあるにもかかわらず、変異を含むセグメントS3がゲルゾリンの活性の調節に機能的に関連していることを示唆している そして321残基の周りの領域はホスホイノシトール-脂質結合部位を含み得る。[His321]ゲルゾリンの機能の変化はras形質転換細胞の腫瘍原性の喪失に重要かも知れない。

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我々は以前に、メタンスルホン酸エチルに付すことにより、活性化H-ras形質転換体EJ-NIH / 3T3からマウスフラット復帰細胞株R1を確立した。R1細胞から、変異ゲルゾリン遺伝子His321をクローニングし、EJ-NIH / 3T3腫瘍に対するHis321の造腫瘍阻害活性を示した。現在の実験は、His321遺伝子が非形質転換NIH / 3T3線維芽細胞に影響を与えるかどうかを調べるために行った。ローダミン-ファロイジン染色により、His321（NIH /λ2S-3およびNIH /λ2S-6）を発現する2つのNIH / 3T3クローンで、ベクターのみをトランスフェクトした2つのクローン（NIH / neo-3およびNIH / neo-5）と同様に組織化されたアクチンのストレスファイバーが形成されることが明らかとなった。また、液体媒体では、NIH / λ2S-3およびNIH / λ2S-6は、NIH / neo-3およびNIH / neo-5よりもゆっくりと成長し、前者の倍加時間は後者の倍増時間よりも約10時間遅かった。細胞増殖に必要なシグナル伝達経路に対するHis321の影響を調査するために、プロスタグランジンE1（PGE1）、血小板由来増殖因子（PDGF）、または上皮増殖因子（EGF）によって細胞株を刺激した。PGE1による刺激はR1細胞の細胞間サイクリックAMPを増加させたが、NIH /λ2S-3およびNIH /λ2S-6細胞では増加しなかった。一方で、PDGFまたはEGFによる刺激では、NIH / neo-3およびNIH / neo5よりもNIH / λ2S-3およびNIH / λ2S-6ではるかに少ないDNA合成が誘導された。これらの結果は、PDGFおよび/またはEGFのシグナル伝達経路への影響を通じてHis321変異ゲルゾリンがNIH / 3T3の成長を阻害することを示唆している。

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さまざまなヒト胃癌細胞株および正常な胃粘膜で産生されるタンパク質を分析した。HSP90の生産は、8つの胃癌細胞株で増加していた。ゲルゾリン含有量は、7つの胃癌細胞株でダウンレギュレートされていた。さらに、GST-piの産生は、低分化腺癌細胞株と2つのスキルス胃癌細胞株で増加していた。これらの結果は、HSP90の生産の増加とゲルゾリンのダウンレギュレーションが胃の発癌に重要な役割を果たすこと、およびGST-piの豊富な生産が一部のスキルス胃癌の独特の行動に関連していることを示唆している。

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アポトーシスに関する最近の大規模な研究は、その分子メカニズムを明らかにし始めている。アポトーシスを調節するいくつかの遺伝子が同定されている。中でも、BCL2遺伝子はアポトーシスを抑制する重要な遺伝子とされている。しかし、まだ同定されていないアポトーシスを抑制する他の遺伝子が存在するはずである。慢性骨髄性白血病におけるBCR-ABL融合タンパク質によるRAS機能の活性化は、BCR-ABLを介した形質転換における重要なメカニズムである可能性があることが示唆されている。したがって、この研究では、内因性H-RAS機能の抑制がK562ヒト慢性骨髄性白血病細胞株におけるBCR-ABLを介した形質転換活性を阻害するかどうかを検討した。K562細胞におけるドミナントネガティブv-H-RAS変異体（116Y）の発現誘導により、細胞死が引き起こされた。死んだ細胞の形態学的特徴およびゲル電気泳動による断片化DNAの検出によって、この細胞死はアポトーシスであることが明らかになった。これらの結果は、BCL2遺伝子だけではなくRAS遺伝子にもアポトーシスを抑制する能力があることを直接示している。

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ヒト活性化Ha-ras癌遺伝子で形質転換されたNIH3T3線維芽細胞（EJ-NIH3T3）から分離された平らな復帰変異体R1は、アクチン調節タンパク質ゲルゾリン（p92-5.7）の変異型を発現している。我々は、p92-5.7をコードするcDNAをクローン化し、p92-5.7の発現の原因として、コドン321の点突然変異を特定した。これにより、プロリンからヒスチジンへのアミノ酸変化が生じる。ras形質転換細胞の復帰におけるp92-5.7の役割を理解するために、p92-5.7またはコントロールとしてヒトの正常ゲルゾリンをコードするcDNAをEJ-NIH3T3細胞にトランスフェクトした。p92-5.7を生産したすべてのトランスフェクタントと、ヒトの正常ゲルゾリンを生産した3つのトランスフェクタントの1つは、同系マウスでの腫瘍形成性を失うか減少していた。これらの結果は、変異したゲルゾリンがras腫瘍を抑制できることを示しており、正常ゲルゾリンは、レベルを上げて発現させた場合、同様の抑制能力がある可能性があることを示唆している。我々のデータは、哺乳類のrasプロトオンコジーンが関与する細胞シグナル伝達経路におけるゲルゾリンの重要な役割を提案する。

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元の細胞株PC10から、2つのシスプラチン耐性ヒト肺扁平上皮癌細胞株PC10-B3およびPC10-E5を樹立した。シスプラチン耐性に関連するタンパク質を発見するために、PC10、PC10-B3、PC10-E5間のタンパク質発現の変化を分析するために、2次元ゲル電気泳動を実施した。PC10-B3およびPC10-E5をPC10と比較すると、タンパク質スポットMr. 50 kDa、pI 5.3は著しく減少し、スポットMr. 50 kDa、pI 4.9は増加していた。スポットMr. 58 kDa、pI 5.8はPC10-E5にのみ新たに出現していた。細胞分画により、Mr. 50 kDa、pI 5.3（p50-5.3）とMr. 50 kDa、pI 4.9が核画分に含まれる一方で、Mr. 58 kDa、pI 5.8は細胞質ゾルとミクロソーム画分の間で検出された。劇的に減少したスポットp50-5.3のin situ消化後のマイクロシーケンスの結果、50 kDaのI型ケラチン（K14）と同一であることが明らかとなった。さらに、レチノイン酸を介したK14の減少は、PC10でのシスプラチン耐性の4.0倍の増加を伴っていました。我々のレポートは、PC10-B3とPC10-E5における劇的なK14減少とシスプラチン耐性の可能な関連を示唆する最初のものである。

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この論文では、Xenopus laevisのTFIIDτcDNA（図1）の分離について説明する。C末端コアドメインの完全な保存に加えて、ヒト（5）およびマウスTFIIDτ（12）のN末端領域に認められる構造モチーフのほとんどもアフリカツメガエルで高度に保存されている。特にグルタミン残基豊富な領域（アミノ酸残基62-84）のグルタミンは、それぞれのグルタミン間のアミノ酸残基はあまり保存されていないにもかかわらず完全に保存されている。さらに、グルタミンに隣接して位置するセリン-スレオニン-プロリンに富む領域リッチおよびグルタミンリピート領域も高度に保存される。ただし、グルタミンリピート領域中のグルタミンの数は種間で非常に変動する（ヒトでは34 / 38、マウスでは13つ、アフリカツメガエルでは4つ）。TFIIDτの野生型とN末端変異体間での機能性の違いを検出するアクティベーター応答性TFIIDτ依存システムの開発が進行中である。

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PC10-B3と呼ばれるcis-diamminedichloroplatinum（II）（CDDP）に耐性のあるヒト肺扁平上皮癌細胞株をCDDP濃度を段階的に増加させることにより親細胞株のPC10から樹立した。これは、私たちの知る限りでは、CDDP耐性肺扁平上皮癌細胞株を確立した最初の報告である。PC10-B3は、0.5マイクログラム/ mL CDDPの存在下で増殖し続けたが、PC10は生存できなかった。3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイにより、PC10-B3がPC10よりもCDDPに対して11.4倍耐性があり、diammine（1,1 -シクロブタンカルボキシレート）白金（II）（CBDCA）および254-Sに耐性があったが、ドキソルビシンまたはエトポシドには耐性がなかった。PC10-B3は、PC10と比較してDNAインデックスが小さく、セルサイズが大きいという特徴があった。細胞内プラチナ蓄積のレベルは、PC10と比較してPC10-B3で約5〜8倍減少しており、薬剤蓄積の減少がPC10-B3のCDDP耐性に寄与する重要な要因の1つである可能性を示唆している。

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ブタ精巣および脳からの器官共通型アシルホスファターゼの電気泳動的に均一な調製物を、逆相液体クロマトグラフィーにより2つの分子種に分離した。トリプシン分解ペプチドマップ分析から、2つの精巣タンパク質のそれぞれが2つの脳タンパク質の対応する1つと同じであると推定された。次に、精巣からの2つのアシルホスファターゼの完全な一次構造を決定した。1つの分子種は100個のアミノ酸残基で構成された。もう1つは、上記の配列の3番目から100番目の残基と同一の98アミノ酸残基からなり、アミノ末端のアラニンでもアセチル化されている。98残基の配列は、ブタの筋肉のアシルホスファターゼと59％の相同性しかないが、ヒトの赤血球のアシルホスファターゼと92％の相同性がある。

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ブタには2種の臓器共通形アシルホスファターゼがあり,一方は他方のアミノ末端部にSer-Metの2残基が付いた型になっていた

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RAP30は、RAP74とともに、RNAポリメラーゼII固定化アフィニティークロマトグラフィーによりRNAポリメラーゼII関連タンパク質として最初に同定された。その後、RAP30に対する抗体を使用して、TFIIFのRAP30は小サブユニットであることが明らかとなった。アフィニティ精製されたRAP30のペプチド配列情報に基づいて機能的なRAP30サブユニットのcDNAが分離され、シーケンス分析から234アミノ酸のポリペプチドをコードすることが予測された。他の開始伸長因子と組み合わせたRAP30のアクションの研究のために、我々もまた、ヒトB細胞ライブラリーのスクリーニングによってRAP30 cDNAを単離した。しかしこのRAP30 cDNAのヌクレオチド配列はPCR産物と同様に、Sopt a他によって報告されたヌクレオチドと1つ異なっていた（678位の余分なA）。変更されたシーケンス（図1に下線で示す）では新しいフレーム終了コドンを含み、分子量28,378の249アミノ酸ポリペプチドを予測する。転写メカニズムの研究の主な目的の一つはさまざまな因子の構造機能分析であるが、改訂されたシーケンスは、プライマリシーケンスの可能な構造モチーフと相同性の理解と簡単な突然変異誘発研究の両方にとって重要です。この因子の役割の理解とイニシエーション対伸長プロセスに関与するドメインは特に興味深い。

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ディファレンシャルハイブリダイゼーションにより、ヒトHa-ras癌遺伝子で形質転換した親株のNIH / 3T3細胞株（EJ-NIH / 3T3）よりもフラットな復帰細胞株R1でより高発現する遺伝子に対応する14個のcDNAクローンを単離した。クロスハイブリダイゼーション実験から、5つのシーケンスファミリーが14のクローンを占めていることがわかった。DNAシーケンスにより、5つの選択されたcDNAクローンのうち4つがミトコンドリア遺伝子（チトクロームb、チトクロームcオキシダーゼサブユニットII、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット1および4）であったが、1つのcDNAクローンはアルファ2（タイプI）コラーゲン遺伝子）と相同であった。細胞株のサザンブロット分析ではミトコンドリアゲノムは同様のコピー数を示したが、ミトコンドリア遺伝子の転写産物レベルはR1で最も高く NIH / 3T3で中間、EJ-NIH / 3T3と部分的に復帰したR2細胞株で低かった。アルファ2（タイプI）コラーゲンmRNAレベルは、R1およびNIH / 3T3で高く、R2では中間で、EJ-NIH / 3T3細胞で低かった。これらの結果は、ミトコンドリアおよび細胞外マトリックス成分の発現の複雑な変化が、形質転換細胞の平坦な復帰と密接に関連している可能性があることを示唆してる。

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ゲルゾリンとα-アクチンの発現を復帰細胞株R1で解析して、親株のヒト活性化Ha-ras癌遺伝子形質転換NIH / 3T3（EJ-NIH / 3T3）、非形質転換NIH / 3T3および部分的復帰R2細胞と比較した。ゲルゾリンmRNA発現は、R1細胞で最も強く、R2およびNIH / 3T3細胞で中間であり、EJ-NIH / 3T3細胞で低かった。サザンブロット分析では全体的な再構成もゲルゾリン遺伝子の増幅も検出されなかった。α-アクチンmRNA発現は、R1細胞でNIH / 3T3細胞のレベルに回復していた。R2およびEJ-NIH / 3T3細胞株では、α-アクチンの転写産物は検出されなかった。高いゲルゾリン発現とα-アクチン発現の回復は、R1細胞の腫瘍形成性の喪失を意味する平坦な形態と秩序だった細胞増殖パターンの獲得に関連している可能性がある。

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9つのプロトオンコジーン（c-myc、N-myc、c-fos、C-jun、p53、H-ras、N-ras、c-raf、hst）と他の2つの遺伝子（PCNA、 GST-P）についてLECラットにおける自然発生の肝細胞癌（HCC）で解析した。c-myc、H-ras、N-ras、C-raf、p53、およびPCNA遺伝子の発現が検出されたが、これはLECラットにおけるHCCの発生において大幅に変化しなかった。N-mycおよびhst遺伝子の発現は検出されませんでした。c-fos遺伝子の発現は、HCCの4症例のうち1症例で検出された。c-jun遺伝子の有意な発現増加が8ヶ月齢のLECラットの肝臓組織で観察された。この高発現はHCCの発生に伴って減少した。一方、LECラットにおけるHCCの発生の臨床経過と並行して、GST-P遺伝子の発現が増加した。c-jun mRNA増加のパターンは、GST-P mRNAのパターンとは異なっていた。これらの観察結果はc-jun遺伝子がLECラットにおけるHCCの自然発生に役割を果たす可能性があることを示唆している。

Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

いくつかの動物種の臓器間のアシルホスファターゼアイソザイムの分布を調べた。ブタおよびニワトリの臓器抽出物をアイソザイム特異的抗体で処理し、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動にかけ、その後、ゲルをアシルホスファターゼ活性について染色した。どちらの動物も3つのバンドを示した。1つのバンドは、精巣、筋肉、脳、心臓、脾臓、腎臓、肝臓、および赤血球に広く分布するため、共通型アイソザイムと呼ばれ、他の2つのバンドは、骨格筋に局在するため、筋肉型アイソザイムと呼ばれた。この分類は、アイソザイム特異的抗体に対するアイソザイムの選択的かつ定量的な反応によってサポートされた。筋肉タイプの2つのバンドは同じアミノ酸配列を持ち、-SHグループの修飾のみが異なるため、ブタとニワトリには2つの主要なタイプのアシルホスファターゼしかないことが示唆されている。この結論は、犬、人間、ウサギ、および鳩での同様の実験によって裏付けられた。

Authorship：Lead author   Publishing type：Doctoral thesis   Kind of work：Single Work   International / domestic magazine：Domestic journal  

マウス線維芽細胞NIH/3T3、ヒト活性化c-Ha-ras（EJ-ras）癌遺伝子で形質転換したNIH/3T3（EJ-NIH/3T3細胞）および2つの正常復帰細胞株R1とR2由来の全タンパク質を2次元電気泳動法（IEFおよびNEPHGE）により解析した。数百個のポリペプチドが銀染色により検出された。NIH/3T3細胞およびEJ-NIH/3T3細胞と比較して、正常復帰細胞株で共通する4つのポリペプチド・スポットの変化が認められた。これらの変化の中でも新たに発現するp92-5.7（分子量とpIに基づき命名）は、正常復帰細胞株でのみ検出され、NIH/3T3細胞あるいはEJ-NIH/3T3細胞では認められなかった。さらに、p92-5.7の発現レベルは正常復帰細胞株の扁平な細胞形態や減弱した造腫瘍性と相関していた。p92-5.7はBALB/3T3細胞やマウス胎児線維芽細胞由来の全タンパク質も検出されなかった。R1細胞の全タンパク質細胞分画により、p92-5.7は細胞質に局在することが明らかとなった。定常状態でのR1細胞においてp92-5.7はリン酸化されていなかった。抗ゲルソリン抗体を使用したウエスタンブロット解析の結果、p92-5.7はアクチン制御タンパク質であるゲルソリンのバリアントかゲルソリンに類似したポリペプチドであることが推察された。ゲルソリンmRNAの発現はEJ-NIH/3T3細胞と比較して正常復帰細胞株で高かった。これらの結果は、正常復帰細胞株でのみ検出されるp92-5.7の発現が、少なくとも部分的には正常復帰に関連することを示唆する。この報告は、正常復帰細胞株における特異的タンパク質発現の初めての実証であろう。

Authorship：Lead author   Publishing type：Doctoral thesis   Kind of work：Single Work   International / domestic magazine：Domestic journal  

マウス線維芽細胞NIH/3T3、ヒト活性化c-Ha-ras（EJ-ras）癌遺伝子で形質転換したNIH/3T3（EJ-NIH/3T3細胞）および2つの正常復帰細胞株R1とR2由来の全タンパク質を2次元電気泳動法（IEFおよびNEPHGE）により解析した。数百個のポリペプチドが銀染色により検出された。NIH/3T3細胞およびEJ-NIH/3T3細胞と比較して、正常復帰細胞株で共通する4つのポリペプチド・スポットの変化が認められた。これらの変化の中でも新たに発現するp92-5.7（分子量とpIに基づき命名）は、正常復帰細胞株でのみ検出され、NIH/3T3細胞あるいはEJ-NIH/3T3細胞では認められなかった。さらに、p92-5.7の発現レベルは正常復帰細胞株の扁平な細胞形態や減弱した造腫瘍性と相関していた。p92-5.7はBALB/3T3細胞やマウス胎児線維芽細胞由来の全タンパク質も検出されなかった。R1細胞の全タンパク質細胞分画により、p92-5.7は細胞質に局在することが明らかとなった。定常状態でのR1細胞においてp92-5.7はリン酸化されていなかった。抗ゲルソリン抗体を使用したウエスタンブロット解析の結果、p92-5.7はアクチン制御タンパク質であるゲルソリンのバリアントかゲルソリンに類似したポリペプチドであることが推察された。ゲルソリンmRNAの発現はEJ-NIH/3T3細胞と比較して正常復帰細胞株で高かった。これらの結果は、正常復帰細胞株でのみ検出されるp92-5.7の発現が、少なくとも部分的には正常復帰に関連することを示唆する。この報告は、正常復帰細胞株における特異的タンパク質発現の初めての実証であろう。

Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

再配置および非再配置c-myc発現の調節を、形質細胞腫（S194）とT細胞リンパ腫（BW5147）細胞の間のマウス細胞ハイブリッド（SBWIおよびSBWII）で解析した。異種mRNAサイズ（1.8約2.4 kb）の再構成されたc-mycの発現は、遺伝子の保持に関係なく、これらのハイブリッドで著しくダウンレギュレートされた。一方、再構成されていないc-myc（2.4 kb）の発現は、これらのハイブリッドでは有意な影響を受けなかった。シクロヘキシミドによるSBWIハイブリッド細胞の処理は、再構成されていないc-mycを2〜4倍に増強したが、再構成されたc-mycのダウンレギュレーションをまったく解放しなかったためハイブリッド細胞での再構成されたc-mycのダウンレギュレーションは主に転写後レベルではなく転写レベルであることが示唆された。これは、核ランオンアッセイの結果によって裏付けられた。S194細胞での高レベルのランオン転写産物は、BW5147細胞でのレベルに匹敵するSBWIハイブリッド細胞で減少していた。再構成されたc-mycはS194細胞でヘミメチル化され、パターンはSBWIハイブリッド細胞でも同じで、さらに、ハイブリッド内の再構成されたc-mycのダウンレギュレーションは、5-アザシチジン（5-AzaC）、12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート（TPA）またはフォルスコリンでの処理によっても回復しなかったことからダウンレギュレーションにおいてDNAメチル化またはタンパク質リン酸化は関与しないことが示唆された。S194細胞における再構成されたc-mycのより高いDNase I感度は、BW5147細胞との細胞融合後に、再構成されたc-mycの近傍のクロマチン構造が開いた状態から閉じた状態に変化することで再構成されていないc-mycと同じ程度に減少したと推測される。

Authorship：Corresponding author   Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

マウス胚線維芽細胞株NIH / 3T3、ヒト活性化c-Ha-ras（EJ-ras）癌遺伝子（EJ-NIH / 3T3）によって形質転換されたNIH / 3T3細胞、および2つの平坦な復帰細胞株R1およびR2は、2次元ゲル電気泳動（IEFおよびNEPHGE）で分析した。銀染色により、数百のポリペプチドが分解された。NIH / 3T3およびEJ-NIH / 3T3細胞と比較した場合、4つのポリペプチドスポットの共通の変化が復帰変異体で観察された。これらの変化の内、新しいポリペプチドスポットp92-5.7（分子量x 10（-3）およびpIで指定）が復帰変異体でのみ検出され、NIH / 3T3およびEJ-NIH / 3T3細胞では検出されなかった。さらに、p92-5.7の発現レベルは、平坦な形態と復帰変異体の腫瘍形成性の低下に関連していた。ポリペプチドp92-5.7は、BALB / 3T3細胞、NIHスイスマウス初代胚線維芽細胞、NRK（正常ラット腎臓）細胞、およびL6（ラット筋芽細胞）から抽出された総タンパク質でも検出されなかった。R1細胞からの総タンパク質の細胞内分画により、p92-5.7がサイトゾルに存在することが明らかになった。抗ゲルゾリン抗体を用いたウエスタンブロット分析でp92-5.7がアクチン調節タンパク質であるゲルゾリンの変異型またはゲルゾリン様ポリペプチドである可能性が示唆された。これらの結果は、復帰変異体でのみ検出されたp92-5.7の発現が少なくとも部分的に復帰と関連していることを示唆している可能性がある。これは、平らな復帰変異体における特定のタンパク質発現の最初の報告であろう。

Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

ハイブリッド細胞株は、BALB / c骨髄腫NS-1細胞と、ヒト前立腺からの部分精製されたアンドロゲン受容体（AR）で免疫されたBALB / cマウスのリンパ球との融合によって樹立された。9つのクローンが、免疫沈降アッセイによってARに対する抗体の産生について決定された。「5F4」と呼ばれるクローンの1つが、詳細な特異性の分析のために選択された。クローン「5F4」はARに対するIgMクラスの抗体を分泌した。競合解析は、「5F4」抗体がARのアンドロゲン結合を阻害することを示し、この抗体がARのアンドロゲン結合部位を特定することを示唆している。イムノブロッティング分析は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上で、抗体はARを95 kDと41 kDの2つのタンパク質として認識したことを示した。95 kDタンパク質は単量体ARで、41 kDタンパク質はARのタンパク質分解断片であると考えられる。免疫組織化学分析により、アンドロゲン依存性組織-ヒト前立腺肥大組織、ARが豊富な前立腺癌組織、およびヒト生殖器皮膚の線維芽細胞-が「5F4」モノクローナル抗体で強く染色され、一方アンドロゲン非依存性組織-線維芽細胞がリンパ節、AR欠乏前立腺癌組織およびヒト前立腺癌細胞株、PC-3は染色されなかった。これらの結果はまた、ARに対する抗体の特異性を裏付けている。

Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

アシルホスファターゼは、哺乳類や鳥類のさまざまな組織に見られるユビキタス酵素です。ヒト、ニワトリ、ブタ、ウマでは、アミノ酸配列の異なる2つのアイソザイムが見つかっています。動物種や組織間のアシルホスファターゼアイソザイムの分布を調査するために、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動後の酵素の活性染色手順を開発しました。ブタの組織抽出物を電気泳動にかけた後、ゲルをアシルホスファターゼ活性について、アセチルリン酸と硝酸鉛を含む溶液中で染色した。3つの活動バンドが観察されました。最も遅い動きのバンドは、精製された精巣アシルホスファターゼのそれと一致し、精巣、筋肉、脳、心臓、脾臓、腎臓、肝臓、および赤血球に広く分布しました。他の2つのバンドは骨格筋に局在する精製された骨格筋アシルホスファターゼのモノマーとダイマーに一致しました。

Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート（TPA）処理後、NIH / 3T3細胞でc-fosおよびc-myc mRNAの両方が誘導されることが報告されています。EJ-rasで形質転換されたNIH / 3T3とその非腫瘍形成性のフラット復帰変異型R1細胞におけるc-fosとc-mycの発現に対するTPAの影響を調べました。TPA処理はNIH / 3T3細胞の場合と同様に、c-myc mRNAを誘導しましたが、c-fos mRNAの誘導レベルは、ゆっくりと成長するEJ-ras形質転換NIH / 3T3だけでなく、静止R1細胞でも大幅に減少していました。さらに、血清誘導c-fos発現もEJ-ras形質転換NIH / 3T3およびR1細胞で減少していました。これらの観察は、TPAからc-fos遺伝子への経路がc-myc遺伝子への経路とは異なり、前者の経路が形質転換された表現型ではなく、EJ-rasの発現と関連してダウンレギュレートされ、c-fos mRNAの誘導減少はTPA処理に特異的ではないことを示唆しています。

Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

変異原で処理したヒト活性化c-Ha-ras-1（hu-ac-Ha-ras）遺伝子形質転換NIH 3T3細胞（EJ-NIH 3T3）から、平らな復帰変異体R1が単離した。R1は変化していないトランスフェクトされたhu-ac-Ha-ras DNAを含み、hu-ac-Ha-ras特異的なmRNAおよびp21タンパク質を高レベルで発現していた。トランスフェクション実験により、NIH 3T3細胞はR1細胞のDNAで形質転換できるが、R1細胞はカーステン肉腫ウイルス、EJ-NIH 3T3細胞のDNA、hu-ac-Ha-ras、v-src、v-mos、サルウイルス40ラージT抗原、またはポリオーマウイルスミドルT抗原で再形質転換できないことが明らかになった。体細胞ハイブリダイゼーション解析では、R1がNIH 3T3細胞との融合によって再形質転換されず、EJ-NIH 3T3およびhu-ac-Ha-ras遺伝子形質転換ラットW31細胞の足場非依存性が軟寒天で抑制された。これらの結果は、R1の正常復帰といくつかのがん遺伝子に対する抵抗性は、がんの表現型に必要な細胞内因子の欠陥でなく、むしろ発がんを抑える細胞メカニズムの強化によることを示唆する。

Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

癌遺伝子産物が癌診断のための腫瘍マーカーとしてだけでなく、癌治療のための免疫原としても使用できるかどうかを知ることは、腫瘍免疫学において非常に興味深い。同系線維芽細胞、p60v-srcを産生する大腸菌細胞、または大腸菌産生細胞から抽出された精製p60v-srcタンパク質で免疫されたBALB /cマウスは、ラウス肉腫ウイルス誘発腫瘍に対して移植耐性を示したが、カーステン肉腫ウイルス誘発腫瘍に対しては耐性を示さなかった。対照的に、p60v-srcまたはその派生タンパク質を産生しない細胞、またはニワトリオボアルブミンで免疫したマウスは、有意な耐性を示さなかった。これらの知見は、p60v-srcがマウスの特定の移植拒絶抗原として作用できることを示唆している。

Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：International journal  

ラウス肉腫ウイルス（RSV）誘発マウス腫瘍（CSA1M）に対する同系抗血清を用いた補体依存性細胞毒性（CDC）アッセイに基づく分析では、RSV誘発マウス腫瘍の一般的な腫瘍関連細胞表面抗原（TASA）との交差反応性抗原が、上皮成長因子受容体（EGFR）を過剰発現する2つのヒト腫瘍A431およびMDA-468で共有されていた。一方TASAは、4つのヒト絨毛癌、ヒト肺癌A2182、およびヒト胚線維芽細胞HFFでは発現していなかった。免疫蛍光解析では、A431が抗pp60srcモノクローナル抗体（MoAb）によって検出されるsrc遺伝子産物を発現しなかった。A431から派生したERFR数が減少した2つのバリアントクローン（cl-15およびcl-16）では、親A431細胞と比較して、ほぼ同じ増殖率とトランスフェリン受容体（Tf-R）の発現であった。しかしながら、これらのクローンはTASAの発現を減少していた。さらに、CDCアッセイと酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により、EGFの前処理によってA431のTASAの発現が低下したが、インスリンでは低下しなかったことが明らかになった。これらすべての所見は、交差反応性抗原とRSV誘発腫瘍のTASAおよびEGFRとの密接な関連を示しています。
「担当部分が抽出できない」

Authorship：Lead author   Publishing type：Research paper (scientific journal)   Kind of work：Joint Work  

ブタの精巣からアシルホスファターゼを精製し、その特性をブタの骨格筋のアシルホスファターゼの特性と比較した。精巣酵素の分子量は、沈降平衡分析でブタ骨格筋アシルホスファターゼの分子量と同様に10,600であり、基質としてリン酸ベンゾイルを使用して測定した精巣酵素の比活性は、同じ条件下で筋肉酵素の比活性よりも高かった。精巣酵素のpIは8.3であり、筋酵素の10.6よりも低かった。2つの酵素のアミノ酸組成には顕著な違いがあった。特に、精巣酵素には筋肉酵素には含まれていないヒスチジン残基が2つ存在していたが、その一方で、筋肉酵素に1つ含まれているシステイン残基は精巣酵素には存在していなかった。精巣酵素のカルボキシル末端アミノ酸はリジンであるのに対して、筋肉酵素のカルボキシル末端アミノ酸はチロシンであった。精巣と筋肉の酵素のペプチドマップは、2つの酵素のアミノ酸配列間で大きな違いがあることを示唆した。2つの酵素の抗原構造の違いは、酵素免疫測定法と二重免疫拡散法で実証された。これらの結果は、ブタ精巣アシルホスファターゼがブタ骨格筋アシルホスファターゼとは異なるアイソザイムであることを示している。

Publishing type：Master’s thesis   Kind of work：Single Work  

Book type：Scholarly book

Book type：Scholarly book Participation form：Second Author

Publishing type：Article, review, commentary, editorial, etc. (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：Domestic journal  

Publishing type：Article, review, commentary, editorial, etc. (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：Domestic journal  

Authorship：Lead author   Publishing type：Article, review, commentary, editorial, etc. (scientific journal)   Kind of work：Single Work   International / domestic magazine：Domestic journal  

Publishing type：Article, review, commentary, editorial, etc. (scientific journal)   Kind of work：Joint Work   International / domestic magazine：Domestic journal  

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